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石蠟/冰凍切片TUNEL凋亡熒光

TUNEL凋亡熒光法

TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細胞凋亡的原理是當細胞發生凋亡時,DNA內切酶被激活,核小體間的基因組DNA被切斷,暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)加上帶有熒光素FITC標記的dUTP,從而可以通過熒光顯微鏡進行檢測。


實驗意義

1.TUNEL法是一種分子生物學與形態學相結合的研究方法,可對完整的單個凋亡細胞或者凋亡小體進行原位染色,可以準確反映細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征。

 2.可用于石蠟切片、冰凍切片、培養的細胞等進行細胞凋亡檢測,靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學方法要高。

 3.操作簡便快捷,在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。


驗步驟

1.石蠟切片TUNEL顯色法:


①石蠟切片常規脫蠟至水,脫蠟劑二甲苯,至水劑乙醇;

②PBS漂洗3×5 min;

③加入蛋白酶K工作液37℃反應15-30 min, PBS漂洗3×5 min;

④4%多聚甲醛(pH7.4的PBS)室溫固定15-30 min,PBS漂洗3×5 min;

⑤浸入封閉液(3%H2O2)室溫封閉10 min,PBS漂洗3×5 min;

⑥參考使用試劑盒的說明書配制適量的TUNEL檢測液,其中含有TdT酶、熒光標記液、TUNEL檢測液;

⑦樣品上加入適量TUNEL檢測液,37℃避光孵育60 min,PBS漂洗3×5 min;

⑧選擇是否用DAPI復染細胞核;

⑨使用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下進行觀察。

 

2.冰凍切片TUNEL顯色法:


①新鮮組織經處理后,立即在恒冷冰凍切片機內切片,厚度為5~6 μm;

②防脫玻片,貼片,室溫陰干約12 h;③4%多聚甲醛(pH7.4的PBS)室溫固定10 min,PBS漂洗3×5 min;

④浸入封閉液(3%H2O2)室溫封閉10 min,PBS漂洗3×5 min;

⑤浸入通透液(0.1%Triton X-100溶于PBS中),室溫通透30 S-2 min;

⑥參考使用試劑盒的說明書配制適量的TUNEL檢測液,其中含有TdT酶、熒光標記液、TUNEL檢測液;

⑦樣品上加入適量TUNEL檢測液,37℃避光孵育60 min,PBS漂洗3×5 min;

⑧選擇是否用DAPI復染細胞核;

⑨使用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下進行觀察。

 

結果展示




 TUNEL4.png


實驗完成周期及交付標準

1. 實驗周期:1-2周

2. 交付標準:蠟塊、切片、染色圖片、實驗報告(實驗步驟、試劑、耗材等)


需確認的信息

1. 樣本的種屬

2. 樣本的類型(固定的組織or蠟塊or切片)

3. 是否提供試劑盒

4. 拍照要求


參考文獻

[1] Kim Y H , Jung J C , Jung S Y , et al. Comparison of the Efficacy of Fluorometholone With and Without Benzalkonium Chloride in Ocular Surface Disease[J]. Cornea, 2016, 35(2):234-242.

[2] Qiu W , Wei R , Zhang C , et al. A glycine site-specific NMDA receptor antagonist protects retina ganglion cells from ischemic injury by modulating apoptotic cascades.[J]. Journal of Cellular Physiology, 2010, 223(3):819-826.


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