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石蠟/冰凍切片TUNEL凋亡

TUNEL凋亡顯色法

TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細胞凋亡的原理是當細胞發生凋亡時,DNA內切酶被激活,核小體間的基因組DNA被切斷,暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)加上帶有生物素(Biotin)標記的dUTP即Biotin-dUTP,隨后于辣根過氧化物酶(HRP)標記的streptavidin結合,在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞,從而可以通過普通光學顯微鏡檢測到細胞凋亡。



實驗意義

1. TUNEL法是一種分子生物學與形態學相結合的研究方法,可對完整的單個凋亡細胞或者凋亡小體進行原位染色,可以準確反映細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征。

2. 可用于石蠟切片、冰凍切片、培養的細胞等進行細胞凋亡檢測,靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學方法要高。

3. 操作簡便快捷,在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。


實驗步

1.石蠟切片TUNEL顯色法:


①石蠟切片常規脫蠟至水,脫蠟劑二甲苯,至水劑乙醇;

②PBS漂洗3×5 min;

③加入蛋白酶K工作液37℃反應15-30 min, PBS漂洗3×5 min;

④4%多聚甲醛(pH7.4的PBS)室溫固定15-30 min,PBS漂洗3×5 min;

⑤浸入封閉液(3%H2O2)室溫封閉10 min,PBS漂洗3×5 min;

⑥加入適量TdT酶反應液,暗濕盒中37℃反應1 h,用SSC室溫15 min終止反應后,PBS漂洗3×5 min;

⑦浸入0.3% H2O2封閉內源性過氧化物酶活性,室溫孵育3-5 min,PBS漂洗3×5 min;

⑧滴加Streptavidin-HRP工作液,37℃反應30-60 min,PBS漂洗3×5 min;

⑨滴加DAB顯色液后用去離子水漂洗數次;

⑩選擇是否用DAPI復染細胞核;

?脫水、透明、中性樹膠封片后進行觀察。

 

2.冰凍切片TUNEL顯色法:


①新鮮組織經處理后,立即在恒冷冰凍切片機內切片,厚度為5~6 μm;

②防脫玻片,貼片,室溫陰干約12 h;

③4%多聚甲醛(pH7.4的PBS)室溫固定10 min,PBS漂洗3×5 min;

④浸入封閉液(3%H2O2)室溫封閉10 min,PBS漂洗3×5 min;

⑤浸入通透液(0.1%Triton X-100溶于PBS中),室溫通透30 S-2 min;

⑥加入適量TdT酶反應液,暗濕盒中37℃反應1 h,用SSC室溫15 min終止反應后,PBS漂洗3×5 min;

⑦浸入0.3% H2O2封閉內源性過氧化物酶活性,室溫孵育3-5 min,PBS漂洗3×5 min;

⑧滴加Streptavidin-HRP工作液,37℃反應30-60 min,PBS漂洗3×5 min;

⑨滴加DAB顯色液后用去離子水漂洗數次;

⑩選擇是否用DAPI復染細胞核;

?脫水、透明、中性樹膠封片后進行觀察。


結果展示



 TUNEL2.png


實驗完成周期及交付標準

1. 實驗周期:1-2周

2. 交付標準:蠟塊、切片、染色圖片、實驗報告(實驗步驟、試劑、耗材等)


需確認的信息

1. 樣本的種屬

2. 樣本的類型(固定的組織or蠟塊or切片)

3. 是否提供試劑盒

4. 拍照要求

 

參考文獻

[1] Bing L , Ying-Jie X , Xian-Ming C , et al. Molecular mechanism of inhibitory effects of CD59 gene on atherosclerosis in ApoE (-/-) mice[J]. Immunology Letters, 2013, 156(1-2):68-81.

[2] Ozimati A A . Immunodetection of Smad-4 in developing molar roots of alendronate-treated rats[J]. Archives of Oral Biology, 2013, 58(11):1744-1750.



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