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線粒體組學研究思路

線粒體組學是指圍繞線粒體質量控制為核心的分子生物學研究,主要聚焦于線粒體結構和功能的變化。其中,線粒體功能主要包括:線粒體膜電位、線粒體鈣滲漏、線粒體ROS生成、線粒體抗氧化能力、線粒體有氧呼吸、線粒體轉運、線粒體遺傳、線粒體凋亡信號;線粒體結構包括:線粒體DNA穩態、線粒體有絲分裂、線粒體自噬、和線粒體異源性(同源性)融合。

線粒體組學的優勢和必要性:線粒體既是能量代謝中心、也是信號傳遞中心、更是細胞命運(凋亡或存活)的決定者,因此線粒體對于維持細胞、組織、器官的結構和功能具有重要作用。

 

線粒體組學的應用范圍

1. 代謝、腫瘤等疾病發病和進展的機制研究

2. 線粒體(母系)遺傳疾病的分子診斷和基因篩查

3. 動植物代謝適應和代謝轉變研究

4. 細胞死亡和細胞存活的雙軌研究途徑

5. 線粒體特異性藥物的毒理學和藥理學研究


線粒體組學研究思路

1. 確立線粒體組學是否改變(功能還是結構,選擇一種指標觀察)

2. 聚焦線粒體組學改變的分子過程(氧化、能量、凋亡、鈣信號等)

3. 選用線粒體組學常用的激活和挽救試劑藥物,進行線粒體組學的正反實驗模擬驗證


將線粒體組學的改變上升到疾病的發病或是進展的背景中

樣本獲取(組織、細胞或純化線粒體)——線粒體結構或功能檢測——線粒體結構或功能檢測的亞分子生物過程——線粒體組學正反實驗模擬——線粒體組學在疾病中的確認

 

 

線粒體組學的研究方法

1. 結構研究

a) 線粒體形態學觀察

i. 免疫熒光技術

ii. 電鏡(包括普通電鏡和免疫電鏡)


b) 線粒體DNA基因組穩態篩查

i. 線粒體DNA的復制和拷貝數變化,qPCR法

ii. 線粒體DNA的突變檢測(點突變、框移突變等)

iii. 線粒體SNP突變位點篩查

iv. 線粒體RNA(包括tRNA)功能和含量鑒定,qPCR和WB法


c) 線粒體特異性蛋白轉位、修飾

i. 線粒體凋亡蛋白(細胞色素c釋放)轉位檢測,WB和免疫熒光法

ii. 線粒體內外膜蛋白磷酸化、泛素化、乙酰化、寡聚化檢測,WB或免疫熒光法


2. 功能研究

a) 線粒體呼吸功能

i. 線粒體氧化磷酸化分析,線粒體呼吸測定儀檢測

ii. 線粒體有氧呼吸蛋白變化,WB或ELISA法

iii. 線粒體代謝底物和代謝生成物檢測,ELISA法


b) 線粒體ROS(氧化應激和抗氧化能力)

i. 線粒體ROS生物含量檢測,流式或免疫熒光法

ii. 線粒體ROS介導的磷脂或蛋白氧化:液相質譜儀或WB法

iii. 線粒體ROS類型檢測:熒光探針、ELISA法

iv. 線粒體抗氧化蛋白含量變化:WB、ELISA


c) 線粒體鈣穩態

i. 線粒體鈣瞬時變化檢測:鈣火花(鈣波)檢測

ii. 線粒體基線鈣變化檢測:流式或免疫熒光

iii. 線粒體鈣峰值分析:3D鈣火花測定


d) 線粒體凋亡檢測

i. 線粒體凋亡信號啟動檢測:ELISA法或免疫熒光

ii. 線粒體凋亡特異性過程檢測:cyt-c滲漏免疫熒光和WB法

iii. 線粒體凋亡蛋白譜變化:WB或qPCR法


e) 線粒體膜電位檢測

i. 線粒體膜電位單熒光檢測(功能線粒體標記檢測):流式或免疫熒光

ii. 線粒體膜電位雙熒光檢測(功能和損傷線粒體雙標記檢測):流式或免疫熒光


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