當前位置:首頁 > 科研服務 > 蛋白鑒定及分析 > 蛋白鑒定

基于生物質譜的蛋白鑒定、定量、翻譯后修飾分析

實驗原理

蛋白質經過蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物,在質譜儀中肽段混合物電離形成帶電離子,質譜分析器的電場、磁場將具有特定質量與電荷比值(即質荷比,M/Z)的肽段離子分離開來,經過檢測器收集分離的離子,確定每個離子的M/Z值。經過質量分析器可分析出每個肽段的M/Z,得到蛋白質所有肽段的M/Z圖譜,即蛋白質的一級質譜峰圖。離子選擇裝置自動選取強度較大肽段離子進行二級質譜分析,輸出選取肽段的二級質譜峰圖,通過和理論上蛋白質經過胰蛋白酶消化后產生的一級質譜峰圖和二級質譜峰圖進行比對而鑒定蛋白質。根據離子源的不同,目前用于蛋白分析的主流質譜技術主要有電噴霧離子化質譜(ESI-MS)和基質輔助激光解析電離質譜(MLADI-MS)。質量分析器主要有四極桿分析器(QE)、離子阱分析器(Orbitrap)、飛行時間分析器(MLADI -TOF)。


生物質譜在蛋白分析方面的應用

1. 蛋白鑒定:由于各種蛋白質的氨基酸序列(一級結構)不同,蛋白質被酶解后產生的肽段序列也各異,肽混合物質量數亦具有特征性,稱為肽質量指紋譜(peptide mass fingerprint,PMF),可用于蛋白質的鑒定。

2. 蛋白定量:基于穩定同位素標記法,如SIL AC、QconCAT、iTRAQ等;基于質譜歸一化的非標定量法,如蛋白豐度指數法PAI、多肽匹配數、譜圖計數、碎片離子峰強度(iBAQ),SWATH等。

3. 蛋白翻譯后修飾:根據特定修飾基團的圖譜特點進行翻譯后修飾的鑒定和定位,包括磷酸化、糖基化、巰基和二硫鍵定位、乙酰化、泛素化等。


實驗步驟   

①組織或細胞蛋白提取;

②蛋白酶消化,將蛋白樣品制備成多肽;

③多肽抽提和質譜儀分析,產生肽段質荷比和肽離子質量;

④搜庫、打分、輸出排序;

⑤搜庫后分析,蛋白鑒定、定量或翻譯后修飾分析。


實驗完成周期及交付標準 

1. 實驗完成周期10~30天,

2. 交付標準:

①主要儀器、試劑和實驗方法;

②包含protein ID、gene symbol、spectrum count、u-peptide、z-score、coverage等信息的蛋白鑒定列表;

③所有肽段信息表;

④質譜原始數據(raw data)。


生物質譜圖片.png


需確認的信息

1. 樣品:如果樣品為蛋白質溶液,蛋白質總量≥300mg; 如果是組織樣品,樣品總量≥0.1g; 如果是細胞樣品,細胞數量≥107個;如果是體液樣品,血清≥200ml,腦脊液≥200ml,尿液≥1ml,淚液≥1ml;

2. 樣品采集過程中使用到塑料制品時,盡量使用無色進口產品,以減少塑料制品中雜質對質譜檢測的影響;

3. 確認樣品所屬種屬、分析需求。


文獻參考 

[1]Liu Q, et al. In-depth proteomic characterization of endogenous nuclear receptors in mouse liver. Mol Cell Proteomics. 2013;12(2):473-84.

[2]Ruprecht B, et al. MALDI-TOF and nESI Orbitrap MS/MS identify orthogonal parts of the phosphoproteome. Proteomics. 2016;16(10):1447-56.

[3]Kobayashi D, et al. Identification of a specific translational machinery via TCTP-EF1A2 interaction regulating NF1-associated tumor growth by affinity purification and data-independent mass spectrometry acquisition (AP-DIA/SWATH). Mol Cell Proteomics. 2018 Oct 31. PubMed PMID: 30381327.


分割線.png

匯聚科研工匠·引領醫學轉化

英雄吕布彩金