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PRM

平行反應監測技術(PRM)

PRM是一種基于高分辨、高精度質譜的離子監視技術,能夠對目標蛋白質、目標肽段(如發生翻譯后修飾的肽段)進行選擇性檢測,從而實現對目標蛋白質/肽段進行絕對定量。PRM技術基于Q-Orbitrap為代表的高分辨、高精度質譜平臺,首先利用四級桿質量分析器的選擇能力,用Q1選擇目標肽段的母離子,隨后在collision cell 中對母離子進行碎裂,最后利用Orbitrap分析器在二級質譜中檢測所選擇的母離子窗口內的所有碎片信息。這樣即可對復雜樣本中的目標蛋白質/肽段進行準確地特異性分析。


實驗意義

PRM技術是針對無抗體蛋白的驗證新技術,用于label free, iTRAQ, TMT, SILAC等相對定量蛋白質組數據的驗證,或對復雜樣本中的目標蛋白質進行靶向定量分析。


實驗步驟  

用PRM進行蛋白質組數據驗證的一般步驟為:

PRM步驟圖.png

用PRM對特定蛋白質進行相對/絕對定量的一般步驟為:

PRM步驟圖2.png

 

結果展示  

PRM.png


實驗完成周期及交付標準

1. 實驗周期:一般PRM時間為:5-10天

2. 交付標準:

組學驗證

① 主要儀器、試劑和實驗方法;

② PRM目標離子信息:肽段序列和定量子離子;

③ 方法學重復性評價:三次技術重復的色譜峰面積相對標準偏差(RSD)(預實驗結果)

④ 實驗結果:二級圖譜,XIC圖譜,原始峰面積強度值,矯正后的相對表達量,兩組樣本間的相對比值,t test p值。


相對/絕對定量

① 主要儀器、試劑和實驗方法;

② PRM目標離子信息:肽段序列和定量子離子;

③ 方法學評價:相對定量的重復性評價—測試樣本的三次技術重復的色譜峰面積相對標準偏差(RSD)(預實驗結果);絕對定量的方法學評價—標準品XIC圖譜,LOD,LOQ,線性        范圍,6個稀釋梯度得到的標準曲線及線性公式(每個稀釋度有3次技術重復)

④ 實驗結果:相對定量—二級圖譜,XIC圖譜,原始峰面積強度值,矯正后的相對表達量,兩組樣本間的相對比值,t test p值; 絕對定量—二級圖譜,XIC圖譜,原始峰面積強度值,    根據標準曲線計算得到的蛋白質濃度之,兩組樣本間的相對比值,t test p值

 

需確認的信息

1. 樣品:如果樣品為蛋白質溶液,蛋白質總量≥300mg; 如果是組織樣品,樣品總量≥0.1g; 如果是細胞樣品,細胞數量≥107個;如果是體液樣品,血清≥200ml,腦脊液≥200ml,尿液≥1ml,淚液≥1ml。

2. 樣品采集過程中使用到塑料制品時,盡量使用無色進口產品,以減少塑料制品中雜質對質譜檢測的影響。


文獻參考 

[1]  Navin Rauniyar. Parallel Reaction Monitoring: A Targeted Experiment Performed Using High Resolution and High Mass Accuracy Mass Spectrometry. Int J Mol Sci. 2015 Dec; 16(12): 28566–28581.

[2] Amelia C. Peterson, et al. Parallel Reaction Monitoring for High Resolution and High Mass Accuracy Quantitative, Targeted Proteomics. Mol Cell Proteomics. 2012 Nov; 11(11): 1475–1488.


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